Come Eseguire un'Analisi Spettrofotometrica: 13 Passaggi (con Immagini)

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Passi
Necessità

La spettrofotometria è una tecnica sperimentale utilizzata per misurare la concentrazione di soluti in una soluzione specifica, calcolando la quantità di luce assorbita da quei soluti. Questa tecnica è potente perché alcuni composti assorbono diverse lunghezze d`onda della luce con diverse intensità. Analizzando la luce che passa attraverso la soluzione, puoi identificare determinati soluti in soluzione e quanto sono concentrate quelle sostanze. Uno spettrofotometro è il dispositivo utilizzato per analizzare le soluzioni in un ambiente di laboratorio.

Passi

Parte 1 di 3: Preparazione dei campioni

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 1

1. Accendere lo spettrofotometro. La maggior parte degli spettrofotometri ha bisogno di riscaldarsi prima di poter fornire una lettura accurata. Accendere il dispositivo e lasciarlo riposare per almeno 15 minuti prima di eseguire i campioni.

Usa il tempo di riscaldamento per preparare i tuoi campioni.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 2

2. Pulire le cuvette o le provette. Se stai facendo un laboratorio scolastico, potresti utilizzare provette usa e getta che non hanno bisogno di essere pulite. Se si utilizzano cuvette o provette riutilizzabili, assicurarsi che siano ben pulite prima dell`uso. Sciacquare accuratamente ogni cuvetta con acqua deionizzata.

Fai attenzione alle cuvette perché possono essere piuttosto costose, soprattutto se sono di vetro o quarzo. Le cuvette al quarzo sono progettate per l`uso nella spettrofotometria UV-visibile.

Quando si maneggia la cuvetta, non toccare i lati attraverso i quali passerà la luce (generalmente i lati trasparenti del tubo). Se tocchi accidentalmente questi lati, pulisci la cuvetta con un "kimwipe" (formulato per evitare di graffiare il vetro).

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 3

3. Caricare il volume appropriato di campione nella cuvetta. Alcune cuvette hanno un volume massimo di 1 millilitro (mL) mentre le provette possono avere un volume massimo di 5 mL. Finché il laser che produce la luce passa attraverso il liquido e non attraverso una parte vuota del contenitore, otterrai una lettura precisa.

Se si utilizza una pipetta per caricare i campioni, utilizzare un nuovo puntale per ogni campione per evitare la contaminazione incrociata.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 4

4. Crea una soluzione di controllo. La soluzione di controllo, o `vuota`, contiene solo il solvente chimico in cui è disciolta la soluzione da analizzare. Ad esempio, se hai sciolto il sale in acqua, il tuo "vuoto" conterrebbe solo acqua. Se colori l`acqua di rosso, lo spazio vuoto deve contenere anche acqua rossa. Il bianco ha lo stesso volume della soluzione da analizzare e viene conservato nello stesso tipo di contenitore.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 5

5. Pulisci l`esterno della cuvetta. Prima di posizionare la cuvetta nello spettrofotometro, assicurarsi che sia il più pulita possibile per evitare interferenze da sporco o particelle di polvere. Utilizzare un panno privo di lanugine per rimuovere eventuali gocce d`acqua o polvere che potrebbero trovarsi all`esterno della cuvetta.

Parte 2 di 3: Esecuzione dell`esperimento

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 6

1. Scegli e imposta la lunghezza d`onda della luce con cui analizzare il campione. Utilizzare una singola lunghezza d`onda della luce (colore monocromatico) per rendere il test più efficace. Il colore della luce dovrebbe essere un colore noto per essere assorbito da una delle sostanze chimiche sospettate di essere presenti nella soluzione in esame. Impostare la lunghezza d`onda desiderata in base alle specifiche del proprio spettrofotometro.

In un laboratorio in classe, sarà probabilmente data la lunghezza d`onda.
Poiché il campione rifletterà tutta la luce dello stesso colore quando appare, la lunghezza d`onda sperimentale sarà sempre di un colore diverso da quella del campione.
Gli oggetti appaiono come determinati colori perché riflettono la luce di determinate lunghezze d`onda e assorbono tutti gli altri colori. L`erba è verde perché la clorofilla nell`erba riflette la luce verde e assorbe tutto il resto.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 7

2. Calibrare la macchina con il `vuoto`. Mettere il bianco nel portacuvette e chiudere il coperchio. Su uno spettrofotometro analogico ci sarà uno schermo con una lancetta che si muove in base all`intensità del rilevamento della luce. Quando lo spazio vuoto è dentro, dovresti vedere l`ago spostarsi a destra. Annotare questo valore nel caso in cui ne abbiate bisogno in seguito. Con lo sbozzato ancora nella macchina, impostare l`ago a zero con la manopola di regolazione.

Gli spettrofotometri digitali possono essere calibrati allo stesso modo, avranno solo una lettura digitale. Impostare il grezzo a zero con le manopole di regolazione.

Quando si rimuove il bianco, la calibrazione è ancora corretta. Quando si misura il resto dei campioni, l`assorbanza del bianco viene sottratta automaticamente.

Assicurati di utilizzare un singolo bianco per sessione in modo che ogni campione sia calibrato sullo stesso bianco. Ad esempio, se si svuota lo spettrofotometro, si analizzano solo pochi campioni e si svuota di nuovo lo spettrofotometro, i campioni rimanenti sarebbero imprecisi. Poi devi ricominciare.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 8

3. Rimuovere il bianco e testare la calibrazione. Con il bianco rimosso, l`ago dovrebbe rimanere a 0 (zero) o la lettura digitale dovrebbe rimanere a zero. Riposizionare lo spazio vuoto nel dispositivo e verificare che l`ago o la lettura non cambino. Se la macchina è calibrata correttamente con il tuo grezzo, tutto dovrebbe rimanere a zero.

Se l`ago o la lettura non è zero, ripetere i passaggi di calibrazione con il bianco.

Se continui ad avere problemi, chiedi aiuto o fai controllare il dispositivo per individuare eventuali problemi.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 9

4. Misura l`assorbanza del tuo campione sperimentale. Rimuovere il bianco e posizionare il campione sperimentale nel dispositivo. Far scorrere la cuvetta nella scanalatura appropriata e assicurarsi che sia in posizione verticale. Attendere circa 10 secondi affinché l`ago si fermi o che i numeri digitali smettano di cambiare. Annotare i valori di % di trasmissione e/o di assorbanza.

L`assorbanza è anche nota come densità ottica (OD).

Più luce viene fatta passare, meno luce viene assorbita dal campione. In generale annoterai i valori di assorbanza, che di solito saranno dati come decimali. Ad esempio: 0,43.

Se ottieni un risultato anomalo (come 0,900 mentre il resto è intorno a 0,400), diluire il campione e misurare nuovamente l`assorbanza.

Ripetere la misurazione per ogni singolo campione almeno tre volte e calcolare la media delle misurazioni. Ciò fornisce una lettura più accurata.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 10

5. Ripetere il test con lunghezze d`onda successive della luce. Il tuo campione può contenere più composti sconosciuti la cui assorbanza varia a seconda della lunghezza d`onda. Per escludere l`incertezza, ripetere le misurazioni a intervalli di 25 nm attraverso lo spettro. In questo modo puoi rilevare altre sostanze chimiche che sospetti siano nel soluto.

Parte 3 di 3: Analisi dei dati di assorbanza

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 11

1. Calcolare la trasmissione e l`assorbanza del campione. La trasmissione indica quanta luce che è passata attraverso il campione ha raggiunto lo spettrofotometro. L`assorbimento è la quantità di luce che è stata assorbita da una delle sostanze chimiche nel soluto. Molti spettrofotometri moderni visualizzano la trasmissione e l`assorbimento, ma una volta registrata l`intensità, è possibile calcolare questi valori.

La trasmittanza (T) si trova dividendo l`intensità della luce che è passata attraverso la soluzione del campione per la quantità che è passata attraverso il bianco. Di solito è espresso come decimale o come percentuale. T = io/io₀ dove I è l`intensità del campione e I₀ l`intensità del bianco.
L`assorbanza (A) è espressa come il negativo del logaritmo (esponente) del valore di trasmissione (base-10): A = -log₁₀T. Per un valore T di 0,1, il valore di A è 1 (0,1 è 10 alla -1a potenza), il che significa che il 10% della luce viene trasmesso e il 90% viene assorbito. Per un valore T di 0,01, il valore di A è 2 (0,01 è 10 alla -2a potenza), il che significa che viene trasmesso l`1% della luce.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 12

2. Traccia i valori di assorbanza rispetto alle lunghezze d`onda. Il valore di assorbanza è tracciato sull`asse y verticale rispetto alla lunghezza d`onda della luce utilizzata per un particolare test tracciato sull`asse x orizzontale. Tracciando i valori di assorbanza massimi per ciascuna lunghezza d`onda della luce testata si ottiene lo spettro di assorbanza del campione e si identificano i composti che compongono la sostanza chimica in esame e i loro rapporti.

Uno spettro di assorbimento di solito ha picchi a determinate lunghezze d`onda che consentono di identificare composti specifici.

Immagine titolata Do Spectrophotometric Analysis Step 13

3. Confronta il grafico dello spettro di assorbimento con i grafici noti di composti specifici. I composti hanno uno spettro di assorbimento unico e produrranno sempre un picco alla stessa lunghezza d`onda ogni volta che vengono misurati. Confrontando i tuoi grafici di composti sconosciuti con quelli di composti noti, puoi identificare i solventi che compongono la tua soluzione.

È inoltre possibile utilizzare questo metodo per identificare i contaminanti nel campione. Se ti aspetti un picco chiaro a una certa lunghezza d`onda e ottieni due picchi a lunghezze d`onda diverse, allora sai che qualcosa non va nel tuo campione.